Una singola delezione di lisina Myh11 provoca la dissezione aortica riducendo l'integrità strutturale e la contrattilità aortica

Rapporti scientifici volume 12, numero articolo: 8844 (2022) Citare questo articolo

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Varianti patogene nella catena pesante della miosina (Myh11) causano aneurismi e dissezioni dell'aorta toracica familiare (FTAAD). Tuttavia, i meccanismi patologici sottostanti rimangono poco chiari a causa della mancanza di modelli animali. In questo studio, abbiamo stabilito un modello murino con Myh11 K1256del, la variante patogena che abbiamo trovato in precedenza in due famiglie FTAAD. L'aorta Myh11∆K/∆K mostrava un aumento dello spessore della parete e anomalie ultrastrutturali, inclusa un'adesione cellulare indebolita. In particolare, i topi Myh11∆K/+ hanno sviluppato dissezioni aortiche ed ematomi intramurali quando stimolati con angiotensina II. Meccanicisticamente, la subunità integrina alfa2 (Itga2) era downregolata nelle aorte Myh11∆K/∆K e le cellule della linea cellulare muscolare liscia che si differenziavano da Myh11∆K/∆K inducono cellule staminali pluripotenti. Anche la contrattilità delle aorte Myh11∆K/∆K in risposta alla fenilefrina era ridotta. Questi risultati implicano che l'adesione cellulare non ottimale indicata dalla downregulation di Itga2 provoca un difetto nella contrazione dell'aorta. Di conseguenza, la contrazione difettosa può aumentare lo stress emodinamico alla base delle dissezioni aortiche.

Almeno il 20% dei pazienti con malattia dell'aorta toracica senza caratteristiche sindromiche ha un parente di primo grado affetto, noto come aneurismi e dissezioni dell'aorta toracica familiare (FTAAD)1,2,3. Sono stati identificati quattro geni patogeni associati alla funzione contrattile della muscolatura liscia (ACTA2, MYH11, MYLK e PRKG1)4,5,6,7. Sebbene la FTAAD sia una malattia dell'aorta toracica non sindromica, i pazienti con varianti patogene in questi geni presentano fenotipi aortici simili a quelli delle malattie dell'aorta toracica sindromiche8. MYH11 codifica la catena pesante della miosina specifica del muscolo liscio (SM-MHC) e le varianti patogene in MYH11 sono state riportate nel 2% delle famiglie con FTAAD/dotto arterioso pervio (PDA)9. Le varianti patogene si trovano principalmente nella regione della bobina a spirale C-terminale di SM-MHC e si prevede che influenzino la polimerizzazione dei filamenti spessi4. L'alterazione genetica in Myh11, anche la variante rara o la variante con numero di copie identificata in grandi popolazioni, altera la funzione citoscheletrica e contrattile delle cellule muscolari lisce (SMC) e aumenta lo stress intracellulare in vitro, portando al rimodellamento nella malattia dell'aorta toracica10,11,12 . Tuttavia, la patogenesi di come la variante patogena Myh11 porta alla dissezione aortica rimane poco chiara a causa della mancanza di modelli animali appropriati.

Recentemente, abbiamo segnalato una variante di delezione (K1256del) in MYH11, che interrompe l'allineamento a quattro lisina di K1253-K1256 nella regione della meromiosina leggera, ed è stata completamente conservata tra le specie in due pedigree giapponesi FTAAD indipendenti l'uno dall'altro. altro13. In questo studio, abbiamo sviluppato un modello murino di questa variante patogena Myh11 K1256del utilizzando il sistema CRISPR-Cas9 per valutare la patogenesi della FTAAD originata dalla variante patogena Myh11.

Per studiare gli effetti patologici della variante di delezione di Myh11 1256 K, abbiamo tentato di introdurre questa variante nei topi B6 utilizzando il sistema CRISPR-Cas9, ma questa manipolazione genetica ha provocato letalità embrionale. La causa della letalità embrionale non è stata ulteriormente indagata. Per ridurre gli effetti fuori bersaglio del sistema CRISPR-Cas9, abbiamo utilizzato l'mRNA Cas9 (D10A) per generare quattro topi fondatori (Fig. 1B): tre eterozigoti (un maschio e due femmine) e un omozigote maschio (Fig. 1C, D). Le coppie riproduttrici eterozigoti furono utilizzate per generare omozigoti, ma non riuscirono ad allevare i loro cuccioli. La causa dell'incuria non è stata studiata e rimane sconosciuta. L'omozigote fondatore morì improvvisamente all'età di quattro settimane (per causa incerta ma non per malattia aortica). Successivamente abbiamo raccolto lo sperma dall'omozigote morto, che è stato utilizzato per la fecondazione in vitro e il trasferimento di embrioni con femmine B6. Di conseguenza, abbiamo generato cinque eterozigoti della generazione successiva e li abbiamo incrociati più di tre volte. Successivamente, per l'analisi sono stati utilizzati topi wild-type (WT), eterozigoti (Myh11∆K/+) e omozigoti (Myh11∆K/∆K) ottenuti mediante incrocio di linee. I genotipi di tutti i topi sono stati determinati mediante un'analisi della sequenza del DNA del sito geneticamente modificato (Fig. 1E).